im电竞官网tag标签亲和纯化原理方法
栏目:新闻中心 发布时间:2021-08-26 17:29

固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),简称金属螯合亲合层析,是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸,使之与金属离子发生相互作用,从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等,其中以6个组氨酸残基组合的融合标签(His-Tag)在原核蛋白表达中的应用最为显著。

His-Tag可结合在目的蛋白的C末端或N末端,形成特殊的结构,以便于进行下一步的纯化及检测。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,所以可选择范围广,高盐,存在变性剂以及去垢剂的上样条件下进行纯化,His-Tag正逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

His-tag作为蛋白纯化时的首选标签,其优势在于:

N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;

采用IMAC(固定化金属离子亲合层析)纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便;

His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能;

His-Tag非常小,在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响;His-Tag的免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体;

与其它亲和标签构建成双亲和标签,并可应用于多种表达系统;

His-Tag融合蛋白的适用范围也较广,既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化,也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白,im电竞官网,而后者则通常纯化包涵体蛋白。

His-Tag亲和层析填料

His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用,如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,其原理是利用蛋白质表面的特性,使之被吸附在凝胶柱上,从而达到分离纯化蛋白的目的。

Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同,Ni2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位,其中Ni-IDA螯合了三价,Ni-NTA螯合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高,在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出,与目的蛋白紧密结合,从而导致分离蛋白产量偏低,产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀,粒径更小,并且螯合镍更稳定,能耐受较高的还原剂,使填料更加稳定,镍离子不易脱落。

Ni-IDA和Ni-NTA结构图

IMAC在通常的情况下是比较稳定的,但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂,如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此,E.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂(通常存在于细菌的细胞周质中),导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化His-Tag融合蛋白的实验时,首先需要去除螯合剂。

Ni-NTA亲和层析实验

Ni-NTA分离带His标签的重组蛋白

Ni-NTA装柱,1.6×20cm,柱床体积为10ml;

用缓冲液1平衡2~5个床体积,流速为2ml/min;

将20ml细胞破碎液(50mM PBS,pH7.4,0.5M NaCl)0.45um滤膜过滤,上样,流速为1ml/min;

用缓冲液1再洗2~5个床体积,流速为2ml/min;

用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱,流速为2ml/min,收集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度;

用纯水流洗5个柱床体积,再用20%的乙醇流洗3个柱床体积,流速为2ml/min,柱子置于低温环境中保存。

缓冲液组成: 缓冲液1

50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g,
加适量水溶解后定容到1000ml。

缓冲液2

50mM磷酸盐缓冲液,pH7.4,即pH7.4的PBS溶液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量,水调pH后定容到1000ml。

缓冲液3

不同咪唑浓度的缓冲液B配制:

咪唑浓度   缓冲液1量(ml)   缓冲液2量(ml)  
10mM   98   2  
50mM   90   10  
100mM   80   20  
200mM   60   40  
300mM   40   60  
400mM   20   80  
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